再创丨如何将细菌改造成最完美的“肿瘤杀手”？
如今，虽然科技的发展日新月异，但癌症依旧是严重威胁人类生命健康的疾病之一，在2011年的cell杂志上，Douglas Hanahan和Robert A. Weinberg两位教授将原有的肿瘤细胞六大特征扩增到了十个：自给自足生长信号、抗生长信号的不敏感、抵抗细胞死亡、潜力无限的复制能力、持续的血管生成、组织浸润和转移、避免免疫摧毁、促进肿瘤的炎症、细胞能量异常、基因组不稳定和突变(Hanahan & Weinberg, 2011)。近年来，在实体瘤切除术、化学药物疗法、分子靶向药物等传统疗法的基础上，更多新型的肿瘤疗法的开发为临床医学注入了新的活力，如CAR-T技术、PD-1免疫疗法等。另外，基于合成生物学技术的细菌工程化改造又为癌症治疗提供了全新的思路，细菌疗法由于其更好的靶向性、更低的毒副作用、更广阔的发展空间、更多样的治疗手段逐渐得到科学重视。由此，本文将为大家介绍细菌疗法的最新进展，总结细菌工程化改造的思路方法，分析如何才能够将细菌改造成为最完美的“肿瘤杀手”。
作者：董宇轩
简介：中国科学院大学、深圳先进技术研究院在读硕士，主攻合成生物学改造细菌用于肿瘤治疗方向。本科毕业于大连理工大学环境生态工程专业。本科研究方向： 微生物与金属元素的相互作用以及微生物合成纳米材料的特性表征。
编辑：孟凡康
全文约4500字，阅读时间约为12分钟
Introduction
早在200多年前，医生们就注意到了细菌感染有时会减缓肿瘤生长甚至将其根除。利用细菌治疗癌症的方法的提出发生在19世纪中叶，Busch, Fehleisen, Coley等人分别有目的性地让患者感染化脓性链球菌，虽然早期取得了不错的疗效，但显然患者随后均死于细菌感染。为降低风险，骨外科医生Coley将细菌灭活，制成了“Coley Toxin”，其最终成功治疗了超过1000名患者。更为惊奇的是，1999年的一项对“Coley Toxin”治疗法的分析再次表明，这种治疗方法的成功率居然与现代的癌症治疗方法不相上下(Richardson &Ramirez, 1999)。随后越来越多的细菌被报道可以用来治疗癌症，包括破伤风梭菌、丁酸梭菌等致病菌以及嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌等非致病菌。在揭示了肿瘤内部的缺氧微环境后，沙门氏菌、李斯特菌、梭状芽孢杆菌等兼性或专性厌氧菌被认为是较为理想的肿瘤治疗的选择。沙门氏菌由于其兼性厌氧、靶向能力强、具有天然毒性、易于改造等特点，被认为是最理想的肿瘤治疗体(Forbes,2010)。
但是，如果仅使用天然细菌作为肿瘤治疗，会增加更多的临床风险，由此，合成生物学作为一门新兴的综合性交叉学科，为肿瘤治疗的细菌工程化改造提供了最具潜力的方案。对于细菌工程化改造的中心问题，应该着重于降低细菌毒性、提高靶向能力和多样化的功能性改造、毒性降低可增加最大耐受剂量;改善靶向能力可增加肿瘤定植; 多样化的功能性改造可以赋予细菌更多的肿瘤治疗的能力。机器正在生物化，生物正在工程化，利用合成生物学将细菌重编程为微小的“机器工厂”（fig.1），将为肿瘤治疗提供一个理想模型，这个“机器工厂”能够感受外部压力、响应内在环境信号、具有自推进能力和靶向肿瘤的特异性，具备选择性毒性以及易于临床检测(Forbes,2010)。
Fig.1：完美的细菌机器工厂模型
Results
1. 靶向肿瘤的特异性
肿瘤异质性是恶性肿瘤具备的特征之一 ，这种异质性的存在使肿瘤的生长速率、侵袭能力、耐药性等方面都有相应影响，这也被成为肿瘤治疗的“拦路虎”。但幸运的是，异质性导致了肿瘤内部的缺氧环境，这为细菌治疗提供了先决条件，兼性厌氧菌或专性厌氧菌可以在肿瘤组织内大量增殖，与肿瘤细胞竞争营养物质，抑制肿瘤生长。与传统的化疗药物相比，细菌药剂的体内输入是一个主动的运输过程，细菌可以依靠鞭毛游动性自我推进，自主寻找适合自身生长的环境，传统的药物递送是依靠血液的流动性被动给药，这就导致了药物不能更好的深入肿瘤组织内部，降低 了肿瘤治疗效果。肿瘤表面复杂的血管系统和结构促使肿瘤能够抵抗外部因子的侵袭和渗入，但细菌的渗透性是依赖于其能够识别肿瘤表面的天冬氨酸、丝氨酸等的小分子梯度(Kasinskas & Forbes, 2007)，宿主的免疫系统和其他组织的氧气浓度又能够避免细菌的逃逸。
另外，兼性厌氧菌靶向肿瘤的机制更为复杂，包括在肿瘤混沌的脉管系统中的细菌包埋、随炎症反应浸润到肿瘤中、在肿瘤特异性微环境中优先生长等等(Forbes, 2003)，这给临床治疗增加了很大的潜在风险。所以，对于兼性厌氧菌的合成生物学改造成为必然，香港大学黄建东教授研究团队通过基因工程重组技术和合成生物学的理念成功将沙门氏菌改造为专性厌氧菌YB1(Yu et al., 2012)。为避免细菌天然毒性对于宿主机体过度的危害性，对于细菌的减毒处理是必要的，沙门氏菌可以通过缺失参与代谢的物质来降低毒性，同时又保存了细菌原有的侵袭能力和对肿瘤组织的专一趋向性(Freeman et al., 2001)。
2. 细菌治疗的功能性改造
2.1 癌症的早期筛查检测
由于大部分癌症在早期症状不明显、潜伏期较长，从而导致患者极易错过治疗的黄金时期，更令人“谈癌色变”的是，很多癌细胞发展的速度之快令人咋舌，很有可能几个月内就会扩散、转移，并很快发展为晚期，所以研发癌细胞的检测工具作为早期癌症的筛查系统尤为重要。现代医疗通常将肿瘤标志物用于临床的早期筛查诊断和预后疗效预测(Deyati,Younesi, Hofmann-Apitius, & Novac, 2013)，但肿瘤标志物在癌症早期的检测的效果难以满足要求，开发新的筛查方法成为肿瘤治疗的一个新的方向。UCSD和MIT的研究团队将大肠杆菌改造成特殊的生物传感器（fig.2a），从而就能够检测肝脏中的肿瘤，随后还能够对尿液进行检测，通过简单的颜色变化来判断患者的肿瘤进展情况(Bhatia,2015)。基于癌症初期血液中钙含量升高的特征，来自瑞士巴塞尔大学的Martin Fussenegger教授和他的团队开发了一种基于合成生物学的生物医学纹身（fig.2b），当这些工程化的细胞植入到皮下后，就能通过分泌诱发细胞变黑的黑色素来对血液中钙质水平的增加产生反应 ，检测癌症引起的高钙血症(Fussenegger,2018)。
Fig.2a：PROP-Z诊断平台工作模式图
Fig.2b：生物医学纹身原理图
2.2 细菌免疫疗法
由于肿瘤细胞的免疫逃逸机制，导致宿主免疫系统无法识别并正常杀伤肿瘤细胞，另外肿瘤细胞招募或诱导免疫抑制细胞阻碍抗肿瘤免疫活性的诱导和发展，将免疫系统作为其自身生长的“帮凶”，所以如何唤醒免疫系统和重新寻找肿瘤细胞作用靶点成为了生物医药界的难题。2012年，Karbach J等报道了“Coley Toxin”的作用机制其实是重新唤醒了的宿主的免疫系统对肿瘤细胞有抑制作用(Karbach etal., 2012)，新加坡南洋理工大学的研究员Teoh Swee Hin更新了Coley的研究工作，Teoh和他的同事们，通过使用灭活的梭状芽孢杆菌证明了对肿瘤的抑制作用(Bhave et al., 2015)。
已有报道表明，细菌的分泌物不仅能够间接激活免疫系统，也能够直接作用肿瘤细胞，虽然细菌免疫疗法的机制尚未完全理解，但是迄今为止的研究发现表明细菌疗法在肿瘤微环境中具有强烈的免疫调节作用，所以对于细菌免疫疗法而言，需要解决的关键问题是如何改造细菌作为向宿主递送免疫原性肿瘤抗原的载体。肿瘤微环境中，促肿瘤的炎性细胞包括肿瘤相关巨噬细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、髓源性抑制细胞和调节T细胞等等，采用细菌免疫疗法就是通过将细菌作为药物载体、递送细胞因子干预肿瘤相关免疫细胞的作用，总结归纳如图Fig.2c(Kaimala et al., 2018)。对于细菌免疫疗法的开发及增强激活能力，Min等成功地将减毒的沙门氏菌基因工程化改造分泌创伤弧菌鞭毛蛋白FlaB，刺激TLR5和TLR4信号通路协同活化，提高肿瘤抑制因子的分泌，增强肿瘤抑制效果(Zheng, 2017)。（另外，基于RNA的免疫调控基因电路的癌症免疫疗法相关内容可阅读罗训训同学的Regenesis文章，传送门：癌症免疫疗法：基于RNA的免疫调控基因电路）
Fig.2c：细菌免疫治疗对宿主中不同肿瘤相关免疫细胞类型的多种作用
2.3 药剂载体的靶向运输
理想的细菌药剂载体应该具备选择性递送能力和释放药物的可控性，既要保证药剂释放在特异性靶点位置又要保证释放药物剂量的可操控，对于选择性递送，厌氧细菌的作用明显，通过细菌靶向病灶释放细胞毒素或细胞因子抑制肿瘤生长，比较常用的细胞毒素包括抗肿瘤坏死因子TNFα和TNF相关的诱导凋亡配体TRAIL等，针对药剂释放激发宿主免疫系统应答详见2.2，这里不再过多赘述。对于胰腺癌替代疗法的开发，Wilber Quispe-Tintaya等将放射性同位素与李斯特菌偶联，增强了对肿瘤细胞的杀伤能力(Quispe-Tintaya et al., 2013)。UCSD的Jeff Hasty教授的科研团队基于群体感应基因回路，构建了细菌同步周期性的药物合成和裂解释放系统，最大程度上维持体内较低的细菌定殖数量、减少对周围组织的损伤以及毒副作用(Din et al.,2016)。
Fig.2d：细菌同步周期性裂解回路的构建及表征
Future Perspective
改造细菌的肿瘤疗法需要严格考察生物安全问题，在将细菌改造为“肿瘤杀手”的同时，如何确保改造细菌不会逃逸到自然生态系统中，建立生物安全的防控系统是必要的。比较成功的研究方法包括自杀开关、遗传防火墙和营养缺陷型的细菌改造，重编码生物体的合成能够有效避免工程微生物和天然微生物的相互作用。尽管进一步的研究和开发对于实现这些技术的全部潜力是必要的，但迄今取得的进展让我们感到乐观，即重新编码的生物体有朝一日将有助于临床使用的工程菌的安全。
未来的癌症治疗技术，不能仅仅依靠合成生物学构建的最完美的“肿瘤杀手”改造菌，还需要与传统的癌症治疗技术以及免疫疗法结合利用，这样可以更大程度上地满足治疗需求，同时，另一个发展方向是关于癌症的个性化医疗体系的建立，个性化医疗旨在针对不同患者的基因组信息、免疫系统差异，寻求最优化的治疗方案，达到最高效的治疗效果和最低的毒副作用，未来对于细菌不同功能性的改造，可以组建“肿瘤治疗细菌库”，标准化、工业化、体系化的肿瘤医疗任重道远。
（参考文献在文末）
附作者研究导师及研究所简介
刘陈立 研究员
博士生导师，“青年千人”、中科院“百人计划”，广东省杰青。合成生物学研究所所长、定量合成生物学研究中心主任，主要研究方向是利用合成生物学基因线路探索生物学的基本原理、以及用于肿瘤治疗和定向进化方法开发。
深圳先进技术研究院合成生物学研究所（SIAT-iSynBio）
iSynBio成立于2017年12月，前身是中科院深圳先进技术研究院医药所合成生物学工程研究中心（CSynBER）。合成所采用合成生物学的工程化设计理念，专注于人造生命元件、基因线路、生物器件、多细胞体系等的合成再造研究，旨在揭示生命本质和探索生命活动基本规律。研究所积极开展面向市场的、以产业化为导向的技术转化，力求发展成为国际上具影响力的合成生物学研发基地与产业创新中心。研究所通过打造开放交叉合作的平台，汇聚国内外合成生物学领域青年骨干及海内外领军科学家，目前所内已有11个PI实验室和4个企业联合实验室，已汇聚形成了一个年轻有活力、多学科合作交叉的前沿创新群体。研究所下设3大中心: 定量合成生物学研究中心、合成生物化学研究中心、合成基因组学研究中心。
References
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